Le competenze dell'ufficio di Sanità di Firenze andarono aumentando nel corso del tempo, comprendendo il controllo sanitario dei cibi e delle bevande vendute al pubblico (con particolare attenzione alle macellerie e alle pescherie) e la sorveglianza dei cimiteri e delle sepolture. Esso emanò norme sullo smaltimento dei residui della lavorazione dei bozzoli dei bachi da seta e sulla vuotatura dei pozzi neri e, soprattutto nei periodi di pestilenza, il Magistrato assumeva il controllo dei movimenti delle persone e merci, rilasciava permessi sanitari, apriva o chiudeva le porte della città, ingerendosi in ogni aspetto della vita quotidiana. Durante le epidemie veniva attivato un cordone sanitario per tutto il dominio, pattugliando le coste e il territorio con particolare attenzione per i passi e le strade di collegamento verso gli stati contagiati. Nelle città venivano formate delle deputazioni con il compito di controllare strada per strada che non vi fossero i malati nelle case e che questi fossero trasportati nei lazzaretti separandoli dai congiunti sani, di provvedere al sostentamento dei sospetti rinchiusi nelle loro abitazioni, di permettere l'accesso alle porte della città solo a chi era munito di bullette di sanità, di reclutare e controllare vivandieri, becchini, cerusici e medici. Veniva inoltre eletto un custode di Sanità che aveva il compito di vigilare sui monasteri e sulle carceri.
Al momento dell'istituzione la magistratura era composta da cinque membri che restavano in carica quattro mesi, ma il loro numero variò nel corso del tempo fino a quando, nel 1656, in occasione della peste di Genova, fu fissato a 6 ufficiali. Facevano parte del Magistrato, senza però diritto di voto, anche il provveditore di grascia e il provveditore di dogana.
Dal 1549 l'elezione dei cinque ufficiali era a beneplacito del granduca che li sceglieva tra quei membri del Consiglio dei dugento che, per quanto possibile, non avessero grossi interessi nei traffici di mercanzia. Tra i requisiti richiesti per concorrere alla carica, gli ufficiali dovevano avere un luogo di lavoro e una residenza facilmente raggiungibili per poter essere convocati in qualsiasi momento.
Gli ufficiali prestavano la loro opera gratuitamente e ricevevano un rimborso per i mancati guadagni durante il periodo in cui prestavano la loro opera. Erano coadiuvati da un provveditore, da un cancelliere e da un notaio che invece erano stipendiati. Al provveditore spettava il compito di "scrivere le lettere fuori di stato, formare i pareri" (Dei, p. 67), e controllare l'esecuzione dei provvedimenti presi dal Magistrato avendo particolare attenzione per i lazzaretti e per i luoghi dove si fossero formati focolai epidemici. Il cancelliere, oltre ad autenticare gli atti del Magistrato, doveva "saper fabbricare e formare processi contro quelli che in materia di sanità commettono fraude e disobbedienza" (Giubetti, p. 2); inoltre, aveva il compito di tenere in ordine l'archivio e poteva disporre di un aiuto per mansioni secondarie, come ad esempio la notifica di convocazioni. Nei periodi di sospetta epidemia doveva "attendere al carteggio di tutto lo stato, distendere i bandi, preparare le memorie per formare li pareri ed aiutare nelle sue incombenze al signor provveditore" (Dei, p. 68).
L'amministrazione contabile dell'ufficio di Sanità era controllata dal cancelliere del Magistrato dei Nove; non possedendo la prima una cassa propria, quando era necessario fare spese, la magistratura attingeva ai fondi dei Nove che, a loro volta, provvedevano a recuperarli imponendo collette e tasse.
La residenza del Magistrato variò nel corso del tempo fino a quando, nel 1730, fu fissata presso gli Uffizi nella sede occupata precedentemente dall'Arte dei fabbricanti e linaioli. In questa sede restò fino al momento della sua soppressione avvenuta nel 1778. Il 22 febbraio, nell'ambito delle riforme leopoldine per la riorganizzazione dello Stato toscano, furono aboliti il Magistrato, il Tribunale e la Cancelleria di Firenze, nonché le Deputazioni e Magistrati di Sanità di Pisa, Siena e di tutte le altre città, ad eccezione della Deputazione di Livorno e di Portoferraio. Le loro attribuzioni andarono, per quanto riguardava la corrispondenza con i paesi esteri, alla Segreteria di Stato, la quale a sua volta passava direttamente gli ordini alla Deputazione di Sanità di Livorno; le facoltà di polizia, come ad esempio quelle in materia di stanze mortuarie, cimiteri, cani, licenze per pozzi neri, vennero assorbite a Firenze dai Quattro commissari dei quartieri, a Siena dal Vicario dell'Auditore fiscale e nelle altre città dai rispettivi giusdicenti. Per quanto riguardava poi tutte le competenze attivate nei periodi di epidemia, queste venivano direttamente surrogate dal Granduca che si riservava la facoltà di prendere tutti i provvedimenti considerati necessari.