Precise disposizioni garantivano che nessun ufficiale avesse rapporti d'interesse con i pupilli.
L'organico della magistratura variò con il tempo. Originariamente era costituito da sei ufficiali, di cui uno scelto tra gli iscritti alle Arti minori. Nel 1414 il numero dei componenti fu portato a otto, ma negli anni successivi variò di nuovo. Al momento della sua istituzione la magistratura era eletta dai Signori e Consigli, in alcuni periodi direttamente, in altri attraverso un sistema piuttosto complicato che prevedeva la nomina di appositi elezionari e la "tratta". L'età minima per aspirare alla carica di Ufficiale dei pupilli era di trentasei anni, limite che fu innalzato a quarant'anni a fine Quattrocento. L'incarico durava un anno e ogni sei mesi si procedeva al rinnovo di metà dei membri della magistratura in modo da garantire una continuità di esercizio.
Oltre agli ufficiali responsabili, il personale della magistratura comprendeva varie figure, variabili nel tempo per numero e incarichi. In genere furono sempre presenti un notaio, un camarlingo, un ragioniere e uno scrivano. Per tutti costoro l'incarico era annuale.
Nel 1532 la magistratura sopravvisse al cambio di regime continuando a esercitare le proprie funzioni durante tutto il periodo del Principato mediceo.
Nel 1533 gli Ufficiali risultavano cinque, di cui quattro dovevano provenire dal Consiglio dei Duecento, mentre il quinto era nominato dal principe. Dal 1560 il tribunale fu più volte riformato, ottenendo progressivamente un ampliamento della propria giurisdizione (riforma del 30 agosto 1565). Nel 1690, con motuproprio del 6 novembre, il principe aggiunse la competenza sulle cause di rendiconto intentate dai pupilli divenuti maggiorenni contro i tutori testamentari o nominati per legge, entro il termine di dieci anni dalla fine della tutela.
In epoca medicea il magistrato dei Pupilli stabilì la propria sede nei locali degli Uffizi, dopo che questi furono terminati nel 1580, per volere di Cosimo I, il quale, con la costruzione della fabbrica vasariana, aveva inteso concentrare in un unico edificio le principali magistrature fiorentine.
A fine Seicento la magistratura risultava costituita da cinque membri, tre cittadini eletti per tratta e due membri (un senatore e un giusperito) nominati dal Granduca. Dovevano essere sposati e di età non inferiore ai quarant'anni (faceva eccezione il giusperito per il quale una provvisione del 1638 aveva abbassato il limite a trentacinque anni). L'organico dell'ufficio comprendeva inoltre, tra gli altri, un provveditore, due assessori (entrambi dottori in legge scelti dal Granduca), un cancelliere, un camarlingo, un ragioniere, un massaio.
In epoca lorenese gli Ufficiali dei pupilli subirono nuove modifiche sia nella giurisdizione che nella struttura in concomitanza con le riforme del sistema giudiziario promosse soprattutto da Pietro Leopoldo (1765-1790). Una prima variazione significativa fu introdotta il 30 dicembre 1771 quando il Granduca rinnovò le modalità di nomina dei giudici. Con un provvedimento emanato il 26 maggio 1777 il Magistrato perse le sue già limitate competenze in ambito criminale, che passarono al Supremo tribunale di giustizia. Con motuproprio 4 agosto 1782 gli fu quindi assegnata gran parte della giurisdizione del soppresso tribunale di Mercanzia, che però gli fu tolta pochi anni dopo, il 18 maggio 1793, per essere affidata al Dipartimento e tribunale esecutivo. Nel 1789 si spartì con il Supremo tribunale di giustizia la giurisdizione del Tribunale e Auditore delle regalie e possessioni allora abolito.
Il Magistrato dei Pupilli fu soppresso nel 1808 dal governo napoleonico.