Tuttavia alcuni incidenti verificati nel corso dei tumulti a Livorno indussero il Governo nel novembre del 1848 a sciogliere il Corpo riorganizzandolo. Il decreto del 22 novembre 1848 dispose che la forza destinata al servizio politico della Toscana fosse denominata Gendarmeria Imperiale e Reale e che la forza di pubblica sicurezza fino ad allora preposta fosse abolita. Decise inoltre che la squadra dei Veliti a Cavallo fosse distaccata dal Reggimento dei Veliti e passasse a far parte del reggimento I. e R. Gendarmeria formando nucleo alla creazione dello squadrone di Cavalleria. Il 24 ottobre 1849 con decreto CCVIII il granduca, riassunti i poteri, ristabilì la norma del 1848.
Con il decreto del 30 maggio 1851 viene approvato il Regolamento della Gendarmeria. I compiti della Gendarmeria erano molteplici dal mantenimento dell'ordine interno alla esecuzione delle leggi. Dovevano vigilare sulla conservazione dell'ordine pubblico e della moralità, difendere i cittadini e la proprietà, vigilare sulla sicurezza delle strade, sui vagabondi, sul contrabbando, sull'uso delle armi, sulla pulizia delle strade e delle piazze, sui mendicanti, sul gioco d'azzardo, sul disturbo della quiete notturna, sul trasporto dei cadaveri, sull'illuminazione, sui sospetti e pregiudicati, sui forestieri, arrestare i disertori. In qualità di polizia giudiziaria aveva l'incarico di investigare, raccogliere prove e consegnare i rei ai Tribunali. Per la varietà delle funzioni rendevano conto in base all'attività svolta al Ministero della Guerra al Ministero dell'Interno e al Ministero di Giustizia e Grazia.
Il reclutamento del Corpo prevedeva inoltre età compresa tra i 21 e i 35 anni, altezza minima di braccia 2 e soldi 17, abilità di leggere e scrivere, scapoli o vedovi senza figli, di moralità esemplare. Per la disciplina dei propri sottoposti inizialmente erano incaricati i Consigli di Disciplina di ogni Battaglione che dovevano raccogliere le prove da inviare ai Tribunali coinvolti, o Tribunale militare o Tribunali ordinari.
Con Regolamento approvato con R. Dispaccio del 10 aprile 1856 per la giurisdizione sopra la Gendarmeria viene creato un apposito Auditore Militare.
Nel 1859, con la guerra franco-piemontese all'Austria e l'insurrezione di Firenze del 27 aprile, il granduca Leopoldo II lasciò la Toscana.
Insediatosi il Governo provvisorio, fu inviato a Firenze il Maggiore dei Reali Carabinieri piemontesi Filippo Ollandini con l'incarico di assicurare l'ordine pubblico, collaborando con la Gendarmeria, costituendo localmente comandi territoriali dell'Arma. Il 12 giugno, riuscì a fare approvare un decreto che poneva la Gendarmeria toscana alle dipendenze del Ministero della guerra per l’esecuzione di compiti militari e del Ministero degli interni per il servizio di pubblica sicurezza, con una struttura simile a quella del Corpo dei Carabinieri piemontesi. Il 15 giugno fu nominato comandante della Gendarmeria toscana, portandone a termine la riorganizzazione sul modello dei Carabinieri. Il corpo che ne risultò, ufficializzato il 24 luglio, assunse il nome di "Legione dei Carabinieri Toscani".