Il personale impiegato fu inizialmente composto da un guardaroba maggiore, responsabile della conservazione degli oggetti e masserizie sia "fatte quanto da farne e fabbricarne", un sostituto o sottoguardaroba, un computista ed altri ministri addetti a mansioni inferiori.
Dopo il parziale trasferimento della corte a Palazzo Pitti, negli anni tra il 1550 ed il 1560, la Guardaroba continuò ad essere ubicata in Palazzo Vecchio, ma nella nuova residenza cominciò a formarsi una nuova Guardaroba. Tale sdoppiamento contribuì ad accrescere ulteriormente lo stato di degrado e di confusione che già regnavano nell'ufficio: per tale motivo nel 1637, ad opera del guardaroba maggiore Francesco Coppoli, fu promossa una riforma che ne riorganizzò la struttura, diversificandone le attività e distribuendo in modo più razionale le competenze.
La Guardaroba fu dunque divisa nella Guardaroba del Taglio ed in quella delle Robe fabbricate (partizioni esistenti anche in epoca precedente, ma con ambiti meno definiti). L'Arazzeria e la Galleria rimasero subordinate alla Guardaroba generale, pur mantenendo una propria amministrazione. Alla Galleria furono annesse la Fonderia, o laboratorio farmaceutico, e l'Armeria. Anche il personale impiegato ebbe un notevole incremento. Il guardaroba maggiore mantenne infatti la direzione generale di tutta la Guardaroba, oltre alla soprintendenza sulla Galleria. Gli altri compiti, un tempo di sua pertinenza, furono delegati al personale subordinato (guardaroba del Taglio, primo guardaroba, guardaroba di camera, di palazzi e ville, delle Carrozze, della Cavallerizza, del Tinello, della Galleria, dell'Armeria, delle Maschere), sul quale mantenne la direzione. Il guardaroba maggiore poteva utilizzare altro personale di corte per svolgere gli incarichi espressamente richiesti dal granduca; inoltre, aveva la piena giurisdizione sugli arredi e sulla distribuzione degli alloggi dei cortigiani, mentre per i forestieri doveva operare di concerto con il maggiordomo, al quale competeva l'assegnazione degli appartamenti anche in caso di spostamento della corte. Alla Guardaroba generale erano infine sottoposti tutti i "tavolaccini di palazzo", addetti al servizio di guardia.
La Guardaroba conservò questa struttura organizzativa fino all'estinzione della dinastia medicea, nel 1737.
Durante il periodo della Reggenza lorenese (1737-1765) la Guardaroba subì una limitazione della propria autonomia, soprattutto a causa del trasferimento della corte e del nuovo corso politico-amministrativo dipendente da Vienna. In particolare l'11 maggio 1739 la competenza sulle riparazioni a palazzi e ville, già di pertinenza del guardaroba maggiore, passò all'amministrazione delle Regie Fabbriche.
Nel 1765, con l'avvento al trono di Pietro Leopoldo, la Guardaroba fu sottoposta all'amministrazione della Corte lorenese, alle cui vicende istituzionali fu da questo momento legata.