Nel 1574, alla morte di Cosimo, Francesco diventò Granduca di Toscana, ottenendo la conferma del titolo dal decreto imperiale di Ratisbona del 2 novembre 1575 e dal riconoscimento del re di Spagna nel 1576.
Nella gestione politica e amministrativa del suo regno, a differenza del padre, Francesco I delegò molte competenze ai segretari, tra i quali si distinsero, avvicendandosi od operando contemporaneamente, Antonio Serguidi, Bartolomeo e Giovan Battista Concini, Lelio Torelli. Con l'andare del tempo e con l'esperienza il granduca affinò le proprie capacità e organizzò il disbrigo degli affari interni ed esteri ripartendoli tra i collaboratori più stretti. In particolare ad Antonio Serguidi furono affidati i rapporti con la Santa Sede, con la Spagna e con il governo di Siena e la cura della flotta, Belisario Vinta si occupò principalmente delle relazioni con l'Impero, la Francia e con gli Stati italiani, Lorenzo Corboli fu preposto di preferenza alla giustizia criminale. Nella sua linea diplomatica Francesco adottò una politica decisamente filospagnola. Problematiche, invece, furono le sue relazioni con la Francia, dove la regina madre Caterina de' Medici, ostile al granduca, dava asilo ai fuorusciti fiorentini. Dopo numerose trattative che coinvolsero anche il fratello Ferdinando, cardinale presso la curia romana, nel 1580 il granduca ottenne la cessione delle fortezze di Pitigliano e Sorano, feudo imperiale assegnato fino ad allora alla famiglia Orsini, indispensabili per il controllo di quella parte di territorio allora piuttosto irrequieta.
Per quanto riguarda gli affari interni, tra le iniziative più rilevanti si ricorda l'impegno a risollevare l'economia toscana, gravata da una ridotta produzione e dalla crisi delle attività commerciali, attraverso l'estensione della coltivazione del gelso a sostegno dell'industria della seta, la ricerca di nuovi giacimenti minerari, l'avvio dell'urbanizzazione del porto di Livorno (1577).
Come Cosimo I, anche Francesco promosse l'arte e la letteratura e patrocinò la costruzione di edifici che celebrassero la magnificenza della corte. Tra i vari interventi che si annoverano durante il suo regno, si segnalano i lavori di rinnovo di Palazzo Pitti, il completamento della Galleria degli Uffizi, l'inizio della costruzione della villa di Pratolino e la fondazione dell'Accademia della Crusca (1582).
Francesco ebbe numerosi figli, dei quali pochi arrivarono all'età adulta: due maschi (Filippo, morto a cinque anni, e Antonio, figlio naturale, in seguito riconosciuto), e sei femmine, delle quali sopravvissero soltanto Eleonora e Maria, andate in sposa rispettivamente a Vincenzo Gonzaga, duca di Mantova, ed Enrico IV di Borbone, re di Francia.
Dopo la morte della consorte Giovanna d'Asburgo (9 aprile 1578), Francesco sposò in segreto Bianca Cappello. L'unione fu ufficializzata il 12 ottobre 1579.
Il granduca morì il 20 ottobre del 1587 a causa di una febbre violentissima.