Nell'ottobre del 1587, in seguito alla scomparsa improvvisa del fratello Francesco, Ferdinando divenne il nuovo granduca di Toscana.
Per quanto riguarda i rapporti internazionali, pur continuando a mantenere una linea filospagnola, il nuovo principe, a differenza del suo predecessore, scelse di stringere relazioni amichevoli con la corte francese e con Caterina de' Medici in particolare, come testimonia il suo matrimonio celebrato nel 1589 con Cristina figlia del duca di Lorena, cresciuta a Parigi e tuttavia gradita anche alla corte madrilena. Quello che spingeva Ferdinando I verso la Francia era il timore di un eccessivo rafforzamento della potenza spagnola in Italia. Per questo motivo intervenne nelle lotte per la successione scoppiate in Francia a seguito dell'assassinio di Enrico III, sostenendo presso il papa Clemente VIII la causa di Enrico IV e, dopo la conversione di questi al cattolicesimo, perorando per lui il ritiro della scomunica, che fu concesso nel 1595. Inoltre, per garantire la sicurezza di navigazione alle imbarcazioni toscane che si spingevano nel Mediterraneo occidentale, per non pregiudicare i collegamenti tra il porto di Livorno e quello di Marsiglia e per contenere la crescente espansione spagnola in quest'area, nel 1591 inviò una guarnigione nel castello d'If, impegnandosi a difenderlo in nome di chi alla fine della guerra di successione fosse stato riconosciuto re di Francia.
Anche i contatti diplomatici che Ferdinando riuscì ad instaurare dal 1589 con Elisabetta I d'Inghilterra e che si sarebbero trasformati in un'alleanza dichiarata dopo la morte della regina e l'ascesa al trono di Giacomo I Stuart (1603), contribuirono ad alienare al granduca le simpatie di Filippo II che arrivò a minacciare la revoca del feudo senese e a rafforzare le proprie guarnigioni nei Presidi maremmani e nello Stato di Piombino. Allo scopo di ricomporre i contrasti e di tutelare gli interessi mercantili toscani nell'Europa orientale il granduca aderì allora alla lotta contro i Turchi, cui partecipò con aiuti in denaro e l'invio di un contingente in Ungheria nel 1594. Il risultato non fu quello sperato e anzi, dopo la morte di Filippo II e l'ascesa al trono di Filippo III, i contrasti tra Spagna e Toscana divennero ancora più marcati. Il nuovo sovrano rifiutò a lungo di rinnovare a Ferdinando l'investitura del feudo di Siena, che fu concessa soltanto nel 1605. Contemporaneamente, inoltre, iniziarono a deteriorarsi i rapporti con Enrico IV di Francia, insolvente nei confronti del granduca per più di un milione di scudi d'oro. Per tutelare i diritti su un credito così alto, Ferdinando si rifiutò di restituire la fortezza d'If. Dopo lunghe negoziazioni e l'inclusione della Toscana nella pace di Vervins (1598), si ebbe una momentanea riconciliazione, sancita dalle nozze del sovrano francese con Maria de' Medici che furono celebrate il 4 ottobre 1600, ma neppure l'alleanza matrimoniale poté rendere duraturo il riavvicinamento tra le due corti. Alla fine Ferdinando I dovette optare per una definitiva politica filospagnola.
Per sostenere il commercio ed in linea con il nuovo clima controriformistico, il granduca toscano, che pure negli anni '90 aveva cercato di stringere accordi con l'Impero ottomano, più volte intervenne nel Mediterraneo orientale contro i Turchi, impiegando soprattutto la flotta dei cavalieri di S. Stefano.
Per quanto riguarda la politica interna, Ferdinando I assunse un atteggiamento conservatore, mantenendo e restituendo prestigio, seppure solo a livello formale, alle magistrature repubblicane sopravvissute. Gli affari di governo, invece, rimasero sotto il suo stretto controllo. Con motuproprio del 2 novembre 1587, pochi giorni dopo l'assunzione del titolo granducale, Ferdinando riformò la segreteria con lo scopo di ridefinire le competenze e ridistribuire in maniera più equilibrata i poteri tra i suoi vari collaboratori. In particolare la riorganizzazione comportò la nomina di un primo segretario (Pietro Usimbardi), con compiti di coordinamento e di controllo, e di due segretari con dipartimento (Antonio Serguidi e Belisario Vinta). Uomini di fiducia del granduca e ad esso legati da una fedeltà personale, spesso non fiorentini, i segretari ebbero anche funzioni diplomatiche e di sorveglianza sulle magistrature cittadine.
Fu mantenuto inoltre il ruolo degli auditori, giurisperiti incaricati fin dai tempi di Cosimo I dell'esame delle petizioni inviate dai sudditi al principe. Nel 1600 Ferdinando trasferì questi compiti a un organo collegiale, la Consulta, che svolgeva funzioni di consiglio ristretto di grazia e giustizia ed era composto dagli auditori più eminenti.
Tra le preoccupazioni principali di Ferdinando I ci fu quella del mantenimento dell'ordine pubblico, che si concretizzò in una lotta contro il banditismo condotta nei primi anni '90.
Si interessò inoltre del governo del territorio, promuovendo interventi per la regolamentazione dell'uso di boschi e pascoli, per l'incremento delle colture, in primo luogo dei gelsi indispensabili all'industria serica, curando la vigilanza e la manutenzione della rete idrica e della rete stradale. Spinto anche dai frequenti problemi di rifornimento alimentare e dai suoi stessi interessi di proprietario fondiario, nel 1589 dette avvio alla bonifica della Valdichiana, di parte della Valdinievole e di altre zone lacustri più circoscritte. Nel 1606 fece spostare la foce dell'Arno per scongiurare le frequenti inondazioni della pianura pisana. Gli organi di cui si servì per il controllo sul territorio e sulle amministrazioni comunitarie e che furono a questo scopo potenziati, furono principalmente la magistratura dei Nove conservatori, i cancellieri locali e gli Uffici dei Fossi.
Particolare impegno fu profuso dal principe per il popolamento e lo sviluppo di Pisa e, soprattutto, di Livorno, il cui porto diventava strategico per le importazioni di grano, date le ricorrenti carestie.
Infine, decisivi interventi furono attuati in ambito urbanistico e architettonico: a Firenze tra le altre opere sono da segnalare l'ampliamento di palazzo Vecchio, la costruzione del teatro Mediceo nel palazzo degli Uffizi e del forte Belvedere.
Ferdinando I morì a Firenze nel 1609.