I nuovi e più distesi rapporti tra Carlo V e il principe furono confermati dal matrimonio, celebrato il 29 luglio 1539, di questi con Eleonora figlia di don Pietro di Toledo, viceré di Napoli, esponente di una delle famiglie più potenti ed influenti presso la corte spagnola.
Su un piano più strettamente politico, Cosimo I dimostrò ben presto di voler governare da solo, senza tutele o deleghe, emarginando gli ottimati che pure avevano sperato nella costituzione di un principato in cui alla componente oligarchica fosse riconosciuto un ruolo decisionale importante.
Il nuovo duca, pur rispettando a livello formale la costituzione e le istituzioni tradizionali cittadine, progressivamente arrivò a concentrare su di sé e a gestire in prima persona o attraverso i suoi uomini più fidati non solo l'attività legislativa ma anche l'amministrazione ordinaria. La sua tendenza a controllare ogni aspetto dell'attività di governo lo indusse anche a compiere numerosi e frequenti viaggi per verificare in maniera diretta la situazione nel dominio. Proprio nei confronti di questo adottò una politica del tutto innovativa rispetto alla consueta prassi fiorentina: si operò infatti per reprimere le lotte di fazione, soprattutto a Pistoia, che fino ad allora erano state tollerate perché si riteneva scongiurassero le ribellioni contro la dominante.
Per consolidare la propria sovranità e il controllo sul territorio, Cosimo I rafforzò l'apparato militare e promosse il restauro o la costruzione di numerose fortezze (San Miniato, Arezzo, Pistoia, Prato, Firenze, Fivizzano).
Approfittando delle difficoltà finanziarie dell'imperatore, già pesantemente indebitato con i Medici, con gli accordi di Pavia del 12 giugno 1543 il duca riuscì a farsi restituire le fortezze di Firenze e Livorno che erano state occupate dalle forze di Carlo V nel 1537 e non più restituite. In questo modo Cosimo I prendeva pieno possesso del ducato e poteva dedicarsi a una serie di riforme interne, istituzionali e amministrative. Ridotto sempre più soltanto a livello formale il potere legislativo dei Consigli, il duca creò, proprio nel 1543, le cariche di auditore fiscale (magistrato dotato di ampi poteri non solo in ambito finanziario ma anche in materia di giustizia penale e di competenze in campo annonario) e di auditore delle Riformagioni (segretario dei Consigli dei Duecento e dei Quarantotto e poi, quando fu istituita, della Pratica Segreta. Quest'ultimo aveva competenza sui diritti della corona nei riguardi dei territori del dominio, sulla concessione di fiere e mercati, sullo stato civile in senso lato, sulla politica estera). Le nuove cariche, insieme a quella di Primo Segretario, consolidavano una struttura di governo fortemente accentrata, in cui il principe gestiva l'amministrazione del ducato e i rapporti con le altre magistrature attraverso collaboratori a lui personalmente fedeli.
Nel 1547 fu creata senza alcuna delibera pubblica la Pratica segreta, il consiglio privato composto dai principali ministri del duca con compiti soprattutto consultivi.
Una materia a cui Cosimo I dedicò molta attenzione fu quella della giustizia attraverso l'emanazione di numerose leggi di natura penale e la riorganizzazione del sistema giudiziario. In particolare furono estese le competenze di alcuni tribunali, tra cui la Ruota fiorentina (supremo tribunale d'appello civile), i Conservatori di legge (cui, dal 1545, spettarono le cause riguardanti le categorie socialmente più deboli) e gli Otto di pratica e balia (che nel 1550 acquisirono competenze di giustizia penale). Al principe fu riservato un ruolo cardine anche in questo ambito, spettandogli il diritto di grazia e una giurisdizione straordinaria in materia civile, attraverso il Magistrato supremo, trasformato in tribunale ducale. Collocandosi al di sopra delle leggi da lui stesso emanate, Cosimo non esitò inoltre ad interferire nelle sentenze dei magistrati, anche di quelli ordinari.
Per un controllo amministrativo più stretto sul territorio, che però non pregiudicò le autonomie e i poteri locali, fu riformata la magistratura dei Cinque Conservatori del contado e del distretto attraverso vari interventi legislativi (1548, 1551, 1552).
Anche la politica fiscale fu oggetto di riforma per quanto riguardava sia la tassazione straordinaria (arbitri e accatti) sia quella ordinaria. Sempre in ambito finanziario, un ruolo centrale aveva poi la Depositeria, che fungeva da cassa centrale sia del ducato sia del patrimonio mediceo.
Parte del programma di governo di Cosimo I fu anche una nuova politica culturale, che si esplicò a livello istituzionale nella riapertura dell'università di Pisa (1543) e nella nascita dell'Accademia fiorentina (1541-1542, poi riformata nel 1546-1547).
Dalla metà degli anni Quaranta, nella politica internazionale il duca manifestò un atteggiamento più aggressivo, che sfociò nella guerra contro Siena (1554-1555), dove nel luglio del 1552 era scoppiata una rivolta antispagnola. Il conflitto fu molto impegnativo e si concluse con la capitolazione firmata da Siena nell'aprile del 1555. Nonostante le prime resistenze dell'imperatore a riconoscere la pace e l'acquisizione dei nuovi territori da parte del duca, questi seppe approfittare delle difficoltà in cui Carlo V, abdicando nel 1555, lasciò il figlio Filippo II e nel 1557 ottenne un accordo: Cosimo I riceveva Siena in feudo e restituiva i territori di Piombino e dell'Elba che aveva ricevuto nel 1548, mantenendo solo il controllo su Portoferraio; il nuovo re di Spagna conservava il dominio diretto sull'Argentario con le relative fortificazioni e otteneva l'annullamento dei debiti.
Dalla fine degli anni Cinquanta Cosimo I migliorò decisamente i rapporti con il papato. Nel primo periodo del suo governo, infatti, aveva preso una serie di provvedimenti che l'avevano messo in conflitto con la Curia: l'opposizione all'esazione delle decime ecclesiastiche nel ducato (1537-1540); la controversia per l'attribuzione del beneficio ecclesiastico dell'ospedale di Altopascio; l'istituzione di forme di controllo sui benefici concessi dai rettori civili (1545); l'imprigionamento di venti domenicani di S. Marco e l'espulsione dell'Ordine dal convento (1545). Dal 1559 sul soglio pontificio si alternarono papi più concilianti: Pio IV, prima e, dal 1566, Pio V. Il nuovo accordo con Roma fu sancito dall'adesione del duca ai decreti tridentini e, simbolicamente, dall'episodio della consegna dell'eretico fiorentino Pietro Carnesecchi all'Inquisizione (1566).
Dopo aver acquistato anche Castiglione della Pescaia e l'isola del Giglio dalla famiglia Piccolomini (1558), Cosimo si impegnò in una nuova serie di riforme. Nel 1562, con l'autorizzazione di Pio IV istituì l'ordine cavalleresco di S. Stefano, con sede a Pisa. Nel 1560 abolì le magistrature dei Cinque conservatori e degli Otto di pratica attribuendone le competenze all'unico Magistrato dei Nove conservatori della giurisdizione e del dominio fiorentino. Un anno dopo, grazie al periodo di pace e ad un miglioramento delle finanze ducali, abolì l'arbitrio e, nel 1563, attuò nuove riforme nell'ambito dell'amministrazione della giustizia.
Anche Siena, che rimase sempre distinta dal resto del dominio fiorentino, tanto da assumere il nome di "Stato Nuovo", in contrapposizione allo "Stato Vecchio", dal 1561 visse un periodo di riforme e di riorganizzazione nelle sue strutture amministrative e di governo (tra i provvedimenti principali ci fu l'istituzione di un governatore direttamente dipendente dal duca, che si riservava anche le nomine ai Consigli e alle magistrature più importanti, e la creazione dei Quattro conservatori, omologhi dei "Nove" fiorentini).
Intanto continuavano gli interventi sul territorio con l'ampliamento della rete di fortificazioni e varie operazioni di bonifica.
Il 1° maggio 1564 Cosimo I volle essere affiancato dal figlio Francesco, cui cedette il governo e le rendite del ducato. Mantenne invece il titolo, il controllo sulla politica estera, sulla flotta e sull'Ordine di S. Stefano, il diritto di nomina alle cariche più importanti, i beni allodiali, i capitali commerciali e il beneplacito nelle principali questioni politiche. Le ragioni di questa scelta vanno rintracciate, oltre che nelle precarie condizioni di salute, anche nel tentativo di facilitare la successione e nella speranza di ottenere il titolo granducale.
Effettivamente, nonostante le numerose resistenze in Italia e fuori, il papa Pio V nel 1569 insignì Cosimo I del titolo di granduca di Toscana, incoronandolo solennemente a Roma il 5 marzo 1570. Il riconoscimento da parte imperiale, invece, non arrivò che nel 1576.
Dal 1568 Cosimo fu colpito da vari attacchi apoplettici, l'ultimo dei quali ne causò la morte il 21 aprile 1574 nella villa medicea di Castello, presso Firenze.